Grupo de Biotecnología de la Reproducción INTA EEA Balcarce
En el año 1999 fue presentado a la Agencia Nacional de Investigaciones
un proyecto para poner en marcha la metodología de clonado que tenía
como fin disponer de la misma para sus múltiples usos posteriores en
biomedicina.
Este proyecto fue aprobado y el inicio de actividades en el mismo tuvo lugar
durante el año 2000 en simultaneidad con un proyecto FONTAR financiado
por el BID gracias al cual en los dos años previos se pudo adecuar la
estructura de laboratorios y de equipamiento necesarios para gran parte de los
trabajos de la puesta en marcha de esta biotecnología.
Como producto de lo anterior, durante los meses de septiembre a diciembre del
año 2000 se llevaron a cabo trabajos de investigación que tuvieron
como objetivos la puesta a punto de la metodología del clonado bovino
en el Laboratorio de Biotecnología de la Reproducción de la Estación
Experimental del INTA de Balcarce y la realización de investigaciones
puntuales dirigidas a mejorar la eficiencia de la técnica. Participaron
en esta etapa del proyecto los investigadores del Grupo de
Biotecnología de la Reproducción, Dres. Ricardo Alberio (Responsable
del Grupo), Gustavo Palma, Juan Aller y Germán Kaiser, todos investigadores
del INTA y dos investigadores del Departamento de Biología Molecular
de la Universidad de Munich, Dres. Valeri Zakhartchenko y Ramiro Alberio. Los
trabajos consistieron en la producción de embriones clones producidos
a partir de células somáticas de animales adultos o de fetos.
Brevemente, la metodología utilizada fue la siguiente:
Las células del individuo a clonar fueron cultivadas, multiplicadas y
preparadas para su uso posterior.
Se obtuvieron ovarios de un matadero próximo a la estación experimental.
Estos ovarios fueron lavados y de ellos se obtuvieron los óvulos (ovocitos)
que se encontraban en los folículos. Los óvulos fueron madurados
durante un período de 16 hs momento en el cual se procedió a extraer
sus núcleos por medio de una micropipeta. Inmediatamente después,
con la misma micropipeta fue colocada la célula a clonar en contacto
con la pared del óvulo sin núcleo. Los conjuntos de óvulos
y células a clonar se colocaron en una máquina llamada fusor celular
la cual mediante pulsos eléctricos produce la fusión de la pared
celular del óvulo con la de la célula a clonar ingresando el nuevo
núcleo al óvulo y quedando constituido el embrión. A continuación,
se activó químicamente a este embrión para que diese comienzo
a sus divisiones. Cuando producto de estas divisiones llegó al estadio
de blastocisto (aproximadamente con 160 células) 7 días después
de la fusión, el embrión estuvo en el momento apropiado para ser
colocado en el útero de una vaca llamada receptora.
Durante los dos meses de trabajo destinados a esta etapa del proyecto, se trabajó
con células somáticas de diferentes individuos y con diferentes
características de interés tanto zootécnico como biomédico.
En las trece sesiones de clonado que se llevaron a cabo durante ese período,
se pusieron a fusionar un total de 819 óvulos con células somáticas.
El éxito
de la fusión fue muy alto puesto que se observó un 91.7% de fusiones.
La etapa siguiente en la evaluación del proceso, fue la de óvulos
fusionados que comenzaron la división. Es así que se observó
que el 54% de estos óvulos eran embriones que habían comenzado
la división celular entre las 24 y 36 hs después de ser activados.
Posteriormente, estos embriones de
dos células debían seguir creciendo durante 6 días para
llegar al estadio en que podían ser transferidos a las vacas receptoras.
En esta etapa es en general donde se producen las mayores pérdidas ya
que es muy difícil de mantener en el laboratorio condiciones de cultivo
similares a las que se observan en el útero del animal vivo. A pesar
de ello, a los 7 días después de la fusión se observó
que un 41% de los embriones que habían comenzado la división alcanzaban
el estadio deseado (llamados mórula y blastocisto) lo cual significa
que un 22% de los óvulos fusionados habían llegado a ser embriones
susceptibles de ser transferidos a las vacas receptoras. Esta performance general
puede ser considerada excelente ya que fue similar a la obtenida en otros laboratorios
del mundo que trabajan en la misma técnica desde hace varios años.
La última etapa, la transferencia a las vacas receptoras, resultó
la que presentó algunos inconvenientes. Puesto que los embriones producidos
por esta técnica son de una fragilidad superior a los obtenidos naturalmente,
las exigencias para las receptoras de los mismos también son mayores
que de costumbre. En esta etapa no se había considerado en principio
la
transferencia de los embriones producidos ya que no se sabía si la técnica
iba a dar los resultados que finalmente dio. Como consecuencia de ello, la previsión
de vacas receptoras de los embriones fue mucho menor que la de embriones producidos.
En consecuencia se debió recurrir a animales que tal vez no hubiesen
sido utilizados normalmente. De esta manera, se utilizaron
20 vaquillonas Aberdeen Angus de 22 meses, 25 vacas Aberdeen Angus adultas y
30 vaquillonas Aberdeen Angus x Hereford de 18 meses. En los dos primeros casos,
los animales estuvieron en dos campos del INTA Balcarce y en el último,
en el campo de un productor vecino a la Estación Experimental (Establecimiento
El Regreso de Juan Ercolano). A lo largo de
los dos meses de trabajo se realizaron sucesivos tratamientos de sincronización
de los celos en estos grupos de animales de manera que estuviesen en el momento
fisiológico apropiado para ser transferidos cuando los embriones estuviesen
disponibles. Los embriones fueron transferidos por vía no quirúrgica
dos veces por semana a los animales seleccionados.
A los 45 días de realizadas las transferencias de los embriones se llevó
a cabo un diagnóstico de gestación por medio de ultrasonografía
determinándose que del grupo de las vacas transferidas había 3
con una gestación normal y una de ellas que aparentaba tener mellizos.
La fragilidad de las gestaciones con embriones clonados impidió que se
hiciera en este último caso un examen más detallado para confirmar
si la gestación era doble o simple.
A los cuatro meses se repitió el examen y se observó que dos de
las tres vacas habían tenido un aborto espontáneo. La última
de las vacas gestantes se encontraba en el campo vecino del INTA y tenía
una fecha estimada de parición entre el 15 y 20 de agosto del 2001. Debido
a que esta se trataba de una vaquillona joven y que podía tener mellizos
se decidió adelantar el
momento del nacimiento para evitar un accidente durante el parto. Por ello se
había previsto realizar una cesárea el día 28 de julio,
es decir unos 15 días antes de la fecha de nacimiento prevista.
El día 16 de julio se nos informó que la vaca había aparecido
muerta dos días antes (14 de julio) por la mañana sin ningún
síntoma previo que anunciara que esto podía ocurrir. Cuando se
hizo la necropsia del animal, se pudieron extraer dos fetos que eran, como se
esperaba, dos hembras Holando Argentino, clones de la vaca Holando Argentino
del INTA de la cual
habían sido extraídas las células con que produjeron los
embriones. Debido a que la muerte se había producido dos días
antes fue imposible determinar la causa de la misma. En cuanto a las dos terneras,
se observó que se encontraban muy próximas de término,
es decir que su nacimiento se debía producir en no más de 20 días.
Una de ellas era completamente normal y con
un peso de 25 kg y la otra presentaba diferentes anomalías esqueléticas,
particularmente en la cabeza y los miembros y una importante cantidad de líquido
en la cavidad abdominal. Por el estado de ambos fetos se estimó que los
dos estaban vivos al momento de la muerte de su madre.
En síntesis, 15 días antes de la cesárea programada, la
vaca conteniendo las dos terneras clonadas murió junto con sus crías.
A pesar que los resultados de este trabajo no fueron completamente satisfactorios,
esta experiencia en colaboración con la Universidad de Munich sirvió
para poner a punto una técnica de alta complejidad en nuestra Institución.
La clonación de animales tiene gran relevancia en la generación
de animales modificados genéticamente para la producción de
proteínas de interés farmacéutico (factores de coagulación
sanguínea), para la industria (producción de proteína polimerizante,
quimosina), para la generación de modelos animales para el estudio de
enfermedades humanas (fibrosis quística, esclerosis múltiple,
enfermedad de priones, etc.).
Esta técnica está dando sus primeros pasos y creemos que esta
primera experiencia podrá ser definitivamente mejorada en el futuro próximo.
Los logros de este trabajo fueron múltiples y varios de los resultados
obtenidos serán presentados en el congreso Anual de la Asociación
Argentina de Producción Animal (mes de septiembre en Rafaela) y en el
congreso Anual de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (mes
de enero del 2002, Foz de Iguazú, Brasil).
También, la experiencia obtenida hasta el presente nos sirve en la actualidad
para continuar con los trabajos previstos en el proyecto y aumentar las probabilidades
de poder contar con terneros clonados a partir del año próximo.